The biosynthesis of the cannabinoids [Η βιοσύνθεση των κανναβινοειδών]

Από:

M. Nazir Tahir, Fred Shahbazi, Simon Rondeau-Gagné, John F. Trant

“The biosynthesis of the cannabinoids”

J Cannabis Res. 2021;3:7

https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC7962319/

Περίληψη

“Η κάνναβη ήταν αναπόσπαστο κομμάτι του ευρασιατικού πολιτισμού για χιλιετίες, αλλά ένας αιώνας απαγόρευσης έχει περιορίσει την έρευνα. Με τη διάδοση της νομιμοποίησης, η επιστήμη στρέφεται προς τη μελέτη της φαρμακοποιίας των κανναβινοειδών και απαιτείται ενδελεχής κατανόηση της βιοσύνθεσης τους για την παραγωγή ποικιλιών με συγκεκριμένα προφίλ κανναβινοειδών. Αυτή η ανασκόπηση ερευνά τη βιοσύνθεση και τη βιοχημεία των κανναβινοειδών. Οι οδοί και οι μηχανισμοί δράσης των ενζύμων συζητούνται όπως και η μη ενζυματική αποκαρβοξυλίωση των κανναβινοϊκών οξέων. Υπάρχουν ακόμη πολλά κενά στις γνώσεις μας σχετικά με τη βιοσύνθεση των κανναβινοειδών, ειδικά για τα δευτερεύοντα συστατικά, και αυτή η ανασκόπηση υπογραμμίζει τα εργαλεία και τις προσεγγίσεις που θα εφαρμοστούν για τη δημιουργία βελτιωμένης κατανόησης και επακόλουθης πρόσβασης σε αυτά τα δυνητικά βιοϊατρικά σχετικά υλικά”.

Γραφική περίληψη

Λέξεις κλειδιά: Cannabinoid biosynthesis, Enzymatic transformation, C. sativa, Decarboxylation, Enzymatic mechanism (Βιοσύνθεση κανναβινοειδών, Ενζυματικός μετασχηματισμός, C. sativa, Αποκαρβοξυλίωση, Ενζυματικός μηχανισμός)

Ιστορικό πλαίσιο της επιστήμης της κάνναβης

Το φυτό Cannabis sativa L. (C. sativa) υπήρξε βασικό στοιχείο της ευρασιατικής κουλτούρας. Είναι τεκμηριωμένο σε κινεζικά κείμενα πριν από το 2000 π.Χ. (Russo 2014), στο ινδουιστικό Atharvaveda, που συντέθηκε μεταξύ 1500 και 1000 π.Χ., όπου τιμάται ως ιερό φυτό για τελετουργίες και τελετές (Russo 2005) και σε αιγυπτιακά κείμενα του Νέου Βασιλείου που χρονολογούνται το 1550 π.Χ. (Hallmann-Mikolajczak 2004). Σήμερα, το φυτό C. sativa καλλιεργείται ανοιχτά σε περισσότερες από 86 χώρες στην Αφρική, την Αμερική, την Ασία και την Ευρώπη (United Nations Office on Drugs and Crime 2005), αν και ο αριθμός είναι πιθανότατα πολύ υψηλότερος. Ωστόσο, το ιστορικό του χημικού χαρακτηρισμού του είναι πολύ πιο σύντομο. Η Δ9-τετραϋδροκανναβινόλη (Δ9-Tetrahydrocannabinol, THC), το κύριο ψυχοδραστικό συστατικό, απομονώθηκε για πρώτη φορά ως ακάθαρτη ρητίνη το 1942, όταν προτάθηκε η δομή της (Wollner et al. 1942). Το 1955, το πρώτο κανναβινοειδές, το κανναβιδιολικό οξύ (cannabidiolic acid, CBDA), απομονώθηκε σε καθαρή μορφή από τους Krejčí & Šantavý. Μέχρι τα τέλη της δεκαετίας του ‘60, θεωρήθηκε ότι οι δραστικές ουσίες της κάνναβης ήταν ένα μη αναγνωρισμένο μείγμα τετραϋδροκανναβινολών (Mechoulam 1970). Ένα κρυσταλλώσιμο παράγωγο Δ9-THC παρασκευάστηκε το 1964, επιτρέποντας την εύκολη πρόσβαση στη μητρική ένωση και διασφαλίζοντας ότι η δομή και η στερεοχημεία της είχαν αντιστοιχιστεί σωστά (Gaoni & Mechoulam 1964), με την CBD να ακολουθεί αμέσως μετά (Šantavý 1964). Η βιβλιογραφία περιέχει μια σειρά θεμελιωδών ανασκοπήσεων που καλύπτουν τη χημεία των κανναβινοειδών που ενσωματώνουν την πρόοδο του πεδίου. Η ανασκόπηση του Farnsworth το 1969 καλύπτει βοτανικές εκτιμήσεις της “marihuana” (κάνναβης), τη βιολογική αξιολόγηση του φυτού και των εκχυλισμάτων, τα γνωστά χημικά συστατικά και τη μέθοδο για την ταυτοποίησή τους (Farnsworth 1969). Η επιδραστική ανασκόπηση του Mechoulam το 1970 σχετικά με τη “marihuana chemistry” (χημεία της κάνναβης) συζήτησε την ονοματολογία και τη χημική και την τότε προτεινόμενη βιογονική σύνθεση των κανναβινοειδών (Mechoulam 1970). Το 1975, οι Shoyama et al. στo “biosynthesis of cannabinoid acids” (βιοσύνθεση των κανναβινοειδών οξέων) συζήτησαν πιθανές οδούς που χρησιμοποιούνται για τη σύνθεση κανναβινοϊκών οξέων από κανναβιγερολικό οξύ (cannabigerolic acid, CBGA) (Shoyama et al. 1975). Οι Turner και συνεργάτες συζητούν τα φυσικά συστατικά και τις κατηγορίες μεταβολιτών του φυτού C. sativa στην ανασκόπηση του 1980 (Turner et al. 1980). Ωστόσο, ο τομέας έχει προχωρήσει γρήγορα τις δεκαετίες από τότε, καθιστώντας τα αυτά περισσότερο ως ένα ιστορικό ενδιαφέρον για την εξέλιξη της κατανόησης μας για την κάνναβη. Η πιο πρόσφατη ανασκόπηση για τη βιοσύνθεση της κάνναβης συντάχθηκε από τους Flores-Sanchez & Verpoorte το 2008, περιγράφοντας τη βιοσύνθεση όλων των κύριων δευτερογενών μεταβολιτών του φυτού C. sativa, πχ. φλαβονοειδή (flavonoids), στιλβενοειδή (stilbenoids), τερπενοειδή (terpenoids), αλκαλοειδή (alkaloids), λιγναναμίδια (lignanamides) και φαινοϊκά αμίδια (phenoic amides) επιπλέον των κανναβινοειδών (cannabinoids) (Flores-Sanchez & Verpoorte 2008). Το πεδίο έχει εξελιχθεί σημαντικά στα 12 χρόνια από τότε, ειδικά σε μια πλήρη επανεκτίμηση της σύνθεσης του ελαιοβετολικού οξέος (olivetolic acid), του κοινού προδρόμου των κανναβινοειδών (Taura et al. 2009). Αυτή η ανασκόπηση συμπληρώνει πρόσφατες ανασκοπήσεις για τη δομική βιολογία κανναβινοειδών (Shahbazi et al. 2020), τη βιολογική δραστηριότητα κανναβινοειδών (Kinghorn et al. 2017) και μια εξαιρετική σύντομη εισαγωγική ανασκόπηση στην επιστήμη της κάνναβης από τους Reekie, Scott & Kassiou (2017).

Τα κανναβινοειδή είναι προνυλιωμένα πολυκετίδια (prenylated polyketides) που παράγονται στο φυτό C. sativa (Taura et al. 2007a). Περισσότερες από 1.600 χημικές ενώσεις έχουν απομονωθεί από το φυτό C. sativa, από τις οποίες πάνω από 180 είναι κανναβινοειδή (Hanuš et al. 2016) που μπορούν να ταξινομηθούν σε 11 δομικές οικογένειες (Πίνακας S1) (Kinghorn et al. 2017, Taura et al. 2007, Zirpel et al. 2018, Merlin 2003). Τα πιο άφθονα κανναβινοειδή (φυσικά παρόντα ως το αντίστοιχο καρβοξυλικό οξύ / carboxylic acid) είναι η Δ9-τετραϋδροκανναβινόλη (Δ9-THC ή THC), το κύριο ψυχοδραστικό κανναβινοειδές), η κανναβιδιόλη (CBD) και η κανναβιχρωμένη (cannabichromene, CBC). Αυτά συμπληρώνονται από αρχέτυπα άλλων τάξεων από Δ8-trans-τετραϋδροκανναβινόλη (Δ8-trans-tetrahydrocannabinol, Δ8-THC), κανναβιγερόλη (cannabigerol, CBG), κανναβινοδιόλη (cannabinodiol, CBND), κανναβιελσοΐνη (cannabielsoin, CBE), κανναβικυκλόλη (cannabicyclol, CBL), κανναβινόλη (cannabinol, CBN), κανναβιτριόλη (cannabitriol, CBT) και μια διαφορετική ομάδα (Kinghorn et al. 2017, Taura et al. 2007A, Merlin 2003, Hampson et al. 1998, Lastres-Becker et al. 2005). Σε αυτήν την ανασκόπηση, θα επικεντρωθούμε στη βιοσύνθεση των κύριων κανναβινοειδών, δηλαδή των THC, CBD και CBC, ως τα καλύτερα μελετημένα, τόσο όσον αφορά τη βιοσύνθεση όσο και τις φαρμακολογικές ιδιότητες (Scheckel et al. 1968, Pertwee 2008, Pertwee 2005, FDA and Cannabis: Research and Drug Approval Process (n.d.), Petrosino et al. 2018, Lewis et al. 2017). Για την περιορισμένη γνώση μας σχετικά με τη βιοσύνθεση άλλων κανναβινοειδών, οι αναγνώστες παραπέμπονται αλλού (Ferioli et al. 2000, Husni et al. 2014, Radwan et al. 2015, Wakshlag et al. 2020), με την προειδοποίηση και την ενθάρρυνση ότι απομένει πολλή δουλειά πρέπει να γίνει για την καλύτερη κατανόηση αυτών των βιοχημικών οδών. Ομοίως, οι αναγνώστες που ενδιαφέρονται για τη βιοτεχνολογική σύνθεση κανναβινοειδών μπορούν να δουν στους Luo et al. (2019) και στους Leahy και συνεργάτες μπορούν να δουν για ένα έξυπνο παράδειγμα της χημικής τους σύνθεσης (Shultz et al. 2018). Η βιοσύνθεση των τερπενίων κάνναβης, που υπάρχουν σε μικρές ποσότητες στο φυτό C. sativa (Hillig 2004, Fischedick et al. 2010, Booth et al. 2017, Booth & Bohlmann 2019, Mudge et al. 2019, Zager et al. 2019, Zager et al. 2010) και των προτεινόμενων συνεργατικών φαρμακολογικών αποτελεσμάτων στην κατανάλωση κάνναβης (Livingston et al. 2020, Russo 2011), περιγράφεται αλλού (Flores-Sanchez & Verpoorte 2008, Page et al. 2006).

Στο φυτό C. sativa, τα κανναβινοειδή βιοσυντίθενται ως φυτοπροστατευτικά: στη φρέσκια βιομάζα, το 95% των THC, CBD και CBC υπάρχουν ως όξινοι πρόγονοι τους: τετραϋδροκανναβινολικό οξύ (tetrahydrocannabinolic acid, THCA), κανναβιδιολικό οξύ (CBDA) και κανναβιχρωμενικό οξύ (cannabichromenic acid, CBCA) (United Nations Office on Drugs and Crime 2005). Αυτά αποκαρβοξυλώνονται στις πιο γνωστές μορφές κατά την αποθήκευση, κατά τη θέρμανση ή υπό αλκαλικές συνθήκες (United Nations Office on Drugs and Crime 2005, Ghosh et al. 1940, Adams et al. 1940, Taura 2009). Το “τετραϋδροκανναβινολικό οξύ” ή “THCA” έχει χρησιμοποιηθεί αόριστα και μπορεί να αναφέρεται σε πολλά συνταγματικά ισομερή, προκαλώντας σύγχυση στο φυσιολογικό και φαρμακολογικό προφίλ (Moreno-Sanz 2016). Το 1965, οι Korte et al. (1965) αναγνώρισαν το τετραϋδροκανναβινολοκαρβοξυλικό οξύ (tetrahydrocannabinolcarboxylic acid, 2-καρβοξυ-THC / 2-carboxy-THC, Εικ.1) ως κύριο συστατικό του χασίς. Το 1969, ο Mechoulam ανέφερε για ένα δεύτερο ισομερές οξέος THC, το 4-καρβοξυ-THC (4-carboxy-THC) (Εικ.1) και ονόμασε ως THCA-A αυτό του Korte και ως THCA-B το δικό του (Mechoulam et al. 1969). Το THCA-B βρέθηκε μόνο σε δείγματα χασίς με ελάχιστο έως καθόλου THCA-A και η συνολική συγκέντρωσή του ήταν γενικά χαμηλότερη από 0,5% κατά βάρος. Οι επόμενες μελέτες, ωστόσο, δεν ήταν σε θέση να επιβεβαιώσουν την εμφάνιση THCA-B (De Zeeuw et al. 1972). Επομένως, σε αυτήν την ανασκόπηση, θα χρησιμοποιήσουμε μόνο τον όρο THCA και αυτό θα αναφέρεται πάντα στο THCA-A (2-carboxy-THC, Εικ.1), εκτός εάν αναφέρεται διαφορετικά.

Εικ.1

Δομές σημαντικών κατηγοριών κανναβινοειδών του Cannabis sativa: Δ9-τετραϋδροκανναβινόλη (Δ9-THC ή THC) και τα όξινα αντίστοιχά της (THCA-A/THCA-B), τετραϋδροκανναβιβαρίνη (tetrahydrocannabivarin, THCV), κανναβιδιόλη (CBD) και το όξινο αντίστοιχο της (CBDA), κανναβιγερόλη (CBG), κανναβιχρωμένη (CBC) και κανναβινόλη (CBN)

Το γένος της κάνναβης περιλαμβάνει τρία είδη που ορίζονται από την περιεκτικότητά τους σε φυτοκανναβινοειδή: το χαμηλής περιεκτικότητας σε THC C. sativa L., το υψηλή περιεκτικότητας σε THC, C. indica Lam., και ένα ενδιάμεσο είδος, το C. ruderalis Janisch (Mechoulam 1970, Hartsel et al. 2016, Appendino et al. 2011, Thomas & ElSohly 2016). Ωστόσο, καθώς τα τρία είδη διασταυρώνονται εύκολα και πολλές υπάρχουσες ποικιλίες είναι υβρίδια, μια μονοτυπική ταξινόμηση, το C. sativa, κερδίζει έδαφος με υποδιαιρέσεις σε χημειότυπους και όχι σε είδη (Pellati et al. 2018). Οι ποικιλίες που χρησιμοποιούνται για κατανάλωση ως φάρμακα, που χαρακτηρίζονται από υψηλή περιεκτικότητα σε Δ9-THC, συχνά δεν διακρίνονται μορφολογικά από τις ποικιλίες τύπου ίνας χαμηλής περιεκτικότητας σε THC. Η βιοσύνθεση προχωρά μέσω των ίδιων οδών σε όλα τα είδη.

Τα κανναβινοειδή συντίθενται μέσω μιας κοινής οδού στα τριχώματα

Τα κανναβινοειδή βιοσυντίθενται στα αδενικά τριχώματα, ή “marijuana bud” των θηλυκών λουλουδιών. Τα αρσενικά άνθη φτωχά σε τριχώματα έχουν συνήθως πολύ χαμηλή περιεκτικότητα σε κανναβινοειδή (Livingston et al. 2020). Τριχώματα υπάρχουν επίσης σε βράκτια, φύλλα και στην κάτω πλευρά των λοβών ανθήρων των αρσενικών ανθέων (Mahlberg et al. 1980). Το Trichōma (τρίχωμα), στα ελληνικά για το “hair” (Εικ.S1a) (Kenneth 2018), ταξινομούνται ως με μίσχο (stalked), άμισχα (sessile) ή βολβώδη (bulbous) (Εικ.S1 b-d) (Hammond & Mahlberg 1973). Τα βολβώδη τριχώματα, τα μικρότερα σε μέγεθος, παράγουν περιορισμένα κανναβινοειδή, οι άλλες δύο μορφολογίες είναι υπεύθυνες για όλη σχεδόν την παραγωγή κανναβινοειδών. Τα άμισχα τριχώματα, που υποστηρίζονται από ένα κοντό μίσχο, έχουν μια σφαιρική κεφαλή που περιλαμβάνει έναν πολυκύτταρο δίσκο εκκριτικών κυττάρων με μια υποδερμική κοιλότητα αποθήκευσης μεταβολίτη (Hammond & Mahlberg 1977). Τα τριχώματα με μίσχο έχουν ελαφρώς μεγαλύτερη σφαιρική κεφαλή, που υψώνεται αρκετές εκατοντάδες μικρά πάνω από την επιδερμική επιφάνεια (Mahlberg & Kim 2004). Η σχετική συνεισφορά των άμισχων και με μίσχο τριχωμάτων στην παραγωγή κανναβινοειδών παραμένει ασαφής (Livingston et al. 2020).

Η βιοσύνθεση των κανναβινοειδών παραμένει ατελώς κατανοητή σε μοριακό επίπεδο (Fellermeier & Zenk 1998). Εν συντομία, τα κανναβινοειδή μοιράζονται μια κοινή αρχική οδό: η τετρακετιδική συνθάση (tetraketide synthase, TKS) (Kearsey et al. 2020), μια πολυκετιδική συνθάση τύπου III (polyketide synthase. PKS), καταλύει τη διαδοχική συμπύκνωση του εξανοϋλ-CoA με τρία μόρια μηλονυλ-CoA για να αποδώσει 3,5,7-trioxododecaneoyl-CoA (Εικ.2a) (Taura et al. 2007b). Αυτό κυκλοποιείται και αρωματοποιείται, με την απώλεια του Συνενζύμου Α (Coenzyme A), από την κυκλάση ελαιοβετολικού οξέος (olivetolic acid cyclase, OAC), σε ελαιοβετολικό οξύ (olivetolic acid, OLA) (Gagne et al. 2012). Στη συνέχεια, η αρωματική πρενυλτρανσφεράση (aromatic prenyltransferase) εισάγει την ομάδα πρενυλίου (prenyl) στη θέση της εξαιρετικά πυρηνόφιλης 2-ρεσορκινόλης (2-resorcinol) για να παράσχει κανναβιγερολικό οξύ (CBGA) (Fellermeier & Zenk 1998). Αυτό το ενδιάμεσο πυρήνα στη συνέχεια αποκλίνει για να παρέχει τα κανναβινολικά οξέα (THCA, CBDA και CBCA) που προχωρούν σε THC, CBD και CBC με μη ενζυματική αποκαρβοξυλίωση (Εικ.2a) (Flores-Sanchez & Verpoorte 2009).

Εικ.2

Βιοσύνθεση κανναβινοειδών,A) μια προτεινόμενη βιοσυνθετική οδός κανναβινοειδών για τη Δ9-τετραϋδροκανναβινόλη (Δ9-THC), την κανναβιδιόλη (CBD) και την κανναβιχρωμένη (CBC) συμπεριλαμβανομένου του σχηματισμού παραπροϊόντων (πεντυλοδιαξική λακτόνη (pentyl diacetic lactone, PDAL), εξανοϋλοτριοξικό οξύ λακτόνη (hexanoyl triacetic acid lactone, HTAL) και ελαιοβετόλη (olivetol) που φαίνεται στο διάστικτο πλαίσιο) και τονίζοντας τη χημική μετατροπή της CBD σε THC, που από καιρό πιστεύεται ότι είναι η πηγή της THC, αλλά αυτή η μετατροπή δεν συμβαίνει in vivo. B) Σύνθεση πυροφωσφορικού γερανυλίου (geranyl pyrophosphate, GPP) από πυροφωσφορικό διμεθυλαλλύλιο (dimethylallyl pyrophosphate, DMAPP) και πυροφωσφορικό ισοπεντενύλιο (isopentenyl pyrophosphat, IPP) που καταλύεται από συνθάση πυροφωσφορικού γερανυλίου (geranyl pyrophosphate synthase)

Η συνθάση ελαιοτόλης και η κυκλάση του ελαιοβετολικού οξέος συνεργάζονται για να παραδώσουν το βασικό ενδιάμεσο

Το ελαιοβετολικό οξύ (olivetolic acid, OLA), σχηματίζει τον πολυκετιδικό πυρήνα των κανναβινοειδών (Taura et al. 2009, Gagne et al. 2012, Tan et al. 2018). Από καιρό πιστευόταν ότι η TKS είναι αποκλειστικά υπεύθυνη για τη βιοσύνθεση του OLA, με την αυθόρμητη κυκλοποίηση και αρωματοποίηση που λαμβάνει χώρα μετά την προσθήκη της τρίτης ομάδας μηλονυλίου όπως φαίνεται στο δεύτερο βήμα του (Εικ.2a). Ωστόσο, κατά τη διερεύνηση του ρόλου του ενζύμου, ο Taura και συνεργάτες χρησιμοποίησαν ένα cDNA, που κωδικοποιεί τη συνθάση ελαιοβετόλης (olivetol synthase, OLS) κλωνοποιημένη από το φυτό C. sativa και διαπίστωσαν ότι ανασυνδυασμένη OLS τους δεν παρήγαγε OLA, αλλά μόνο την αποκαρβοξυλιωμένη μορφή του, την ελαιοβετόλη (olivetol) (Εικ.2a) (Taura et al. 2009). Οι συγγραφείς επιβεβαίωσαν επίσης ότι τα ακατέργαστα ενζυμικά εκχυλίσματα είτε των λουλουδιών είτε των φύλλων πρώιμης ανάπτυξης, των δύο κύριων ιστών του φυτού C. sativa που παράγουν κανναβινοειδή, παρείχαν επίσης μόνο ελαιοβετόλη (olivetol) (Taura et al. 2009, Dewick 2002). Αυτό έδειξε έντονα ότι η βιοσύνθεση του OLA δεν εξαρτάται μόνο από την OLS, αλλά μπορεί να περιλαμβάνει άλλα ένζυμα. Ωστόσο, θεώρησαν ότι η ελαιοβετόλη (olivetol) μπορεί να είναι ένα τεχνούργημα των in vitro δοκιμασιών ενζύμων, καθώς η ελαιοβετόλη δεν ανιχνεύεται στο φυτό C. sativa (Taura et al. 2009). Αυτό το αίνιγμα, το OLA δεν μπορεί να παρασκευαστεί in vitro, αλλά το in vitro προϊόν, η ελαιοβετόλη, δεν παρατηρείται in vivo, έχει επιλυθεί από τότε με στοιχεία ότι η διαδικασία απαιτεί κυκλάση ελαιοβετολικού οξέος (olivetolic acid cyclase OAC), για τη διεξαγωγή της ενδομοριακής συμπύκνωσης C2 → C7 αλδόλης (aldol) χωρίς αποκαρβοξυλίωση (Εικ.2a) (Gagne et al. 2012, Tan et al. 2018, Kearsey et al. 2019). Οι Kearsey et al. (2019) επιβεβαίωσαν επίσης ότι, απουσία OAC, εμφανίζει μια μη ενζυματική C2 → C7 αποκαρβοξυλική συμπύκνωση αλδόλης του ενδιάμεσου τετρακετιδίου σχηματίζοντας ελαιοβετόλη αντί για OLA (Εικ.2a). Η μη ενζυματική κυκλοποίηση υποβάθρου δημιουργεί ελαιοβετόλη (Austin et al. 2004). Η κυκλάση διασφαλίζει ότι το καρβοξυλικό επιβιώνει στη βιοσύνθεση.

Αυτό εγείρει ερωτήματα, ωστόσο, καθώς η OLS δεν αλληλεπιδρά με την OAC, επομένως ο μεταβολίτης δεν μεταφέρεται άμεσα, αλλά πρέπει να διαχέεται από το ένα ένζυμο στο άλλο μέσω του κυτοσόλης (cytosol) (Tan et al. 2018). Οι Kearsey et al. διερεύνησαν επίσης την κρυσταλλική δομή της TKS παρουσία CoA (Εικ.3a) και επίσης πραγματοποίησε μια μελέτη μεταλλαξιογένεσης καθοδηγούμενη από τη δομή για να διερευνήσει γιατί το ενδιάμεσο τετρακετίδιο απελευθερώνεται πριν από την κυκλοποίηση χωρίς OAC (Kearsey et al. 2019). Οι Noel και συνεργάτες είχαν προτείνει ότι ένας “aldol switch” (διακόπτης αλδόλης) είναι απαραίτητος για την ενεργοποίηση της απελευθέρωσης τετρακετιδίου, επιτρέποντας έτσι την επακόλουθη παραγωγή ελαιοβετολικού οξέος που καταλύεται από την OAC (Austin et al. 2004). Ωστόσο, το έργο του Kearsey δεν υποστηρίζει την παρουσία μιας καθολικής ή προβλέψιμης συναινετικής ακολουθίας “aldol switch”. Κατά τον σχηματισμό του OLA, σχηματίζονται επίσης μικρές ποσότητες πεντυλοδιαοξικής λακτόνης (pentyl diacetic lactone, PDAL) και εξανοϋλοτριοξικού οξέος λακτόνης (hexanoyl triacetic acid lactone, HTAL) από μη ενζυματική υδρόλυση των μονο- και δι-μηλονυλιωμένων ενδιαμέσων αντίστοιχα (Εικ.2a) (Taura et al. 2007B, Gagne et al. 2012, Kearsey et al. 2019).

Εικ.3

Δομές περίθλασης ακτίνων Χ τριών βασικών ενζύμων που εμπλέκονται στη βιοσύνθεση κανναβινοειδών. Τα βασικά υπολείμματα ενεργών τοποθεσιών επισημαίνονται με πράσινο χρώμα και τα διαγράμματα αλληλεπίδρασης, που δημιουργούνται από τους συγγραφείς χρησιμοποιώντας τη σουίτα υπολογιστικού λογισμικού Schrödinger (Maestro 2020), α) τετραμερικής τετρακετιδικής συνθάσης (tetrameric tetraketide synthase, TKS) από το φυτό C. sativa σε σύμπλοκο με Συνένζυμο Α (CoA, 6GW3), το CoA είναι πορτοκαλί, με τα τέσσερα τετραμερή σε κόκκινο, πορτοκαλί, ανοιχτό πράσινο και κυανό αντίστοιχα (Kearsey et al. 2020), β) επέκταση της ενεργού τοποθεσίας, γ) κυκλάση ελαιοβετολικού οξέος (OAC) από το φυτό C. sativa (5BO9) (Yang et al. 2016), ο θύλακας δέσμευσης πεντυλίου και τα βασικά του υπολείμματα είναι γκρι, το ελαιοβετολικό οξύ (OLA) είναι πορτοκαλί, η αλυσίδα Α είναι γκρι και η αλυσίδα Β είναι σε ανοιχτό πορτοκαλί, δ) επέκταση του ενεργού τόπου, ανεστραμμένη, ε) συνθάση τετραϋδροκανναβινολικού οξέος (tetrahydrocannabinolic acid synthase, THCAS) από το φυτό C. sativa (3VTE) συνδεδεμένη με δινουκλεοτίδιο αδενίνης φλαβίνης (flavin adenine dinucleotide, FAD) και χωρίς πρόσδεμα. Το FAD είναι πορτοκαλί και το πρωτεϊνικό ναυτικό και στ) επέκταση του ενεργού τόπου (Shoyama et al. 2012)

Το OLA στη συνέχεια μετατρέπεται σε κανναβιγερολικό οξύ (CBGA) μέσω της προσθήκης πυροφωσφορικού γερανυλίου (GPP) που καταλύεται από μια αρωματική πρενυλτρανσφεράση (aromatic prenyltransferase, APT) (Lercker et al. 1992). Το GPP συντίθεται με τη συμπύκνωση του πυροφωσφορικού ισοπεντενυλίου (IPP) και του πυροφωσφορικού διμεθυλαλλύλιου (DMAPP) που καταλύεται από τη συνθάση πυροφωσφορικού γερανυλίου (geranyl pyrophosphate synthase, GPS) (Εικ.2b) (Davis & Croteau 2000 και Gerzonman 2000, στη συνέχεια, το CBGA μετατρέπεται σε THCA, CBDA και CBCA (Εικ.2a) (Tan et al. 2018. Shoyama et al. 2012).

Στις δεκαετίες του ‘60 και του ‘70, έχουν διατυπωθεί πολλές εύλογες υποθέσεις σχετικά με τη βιοσύνθεση του THCA. Ωστόσο, από όλους τους έλειπε η πειραματική υποστήριξη. Θεωρήθηκε ότι το THCA προέρχεται από το CBDA μέσω της κυκλοποίησης (Mechoulam 1970, Gaoni & Mechoulam 1964, Shoyama et al. 1975, Taura 2009). Αυτό επιβεβαιώθηκε από τους Gaoni & Mechoulam, οι οποίοι, ενώ καθιέρωσαν τις δομές της CBD και της THC, έβρασαν CBD με 0,05% v/v HCl σε αιθανόλη για 2 ώρες, έλαβαν ένα μείγμα THC και πρώτης ύλης (Εικ.2a) (Gaoni & Mechoulam 1964). Ωστόσο, οι συνθήκες αντίδρασης του μετασχηματισμού διαφέρουν από αυτές που υπάρχουν κατά τη φυσική βιοσύνθεση στα φυτά. Επιπλέον, η δραστικότητα ισομεράσης, η οποία θα ήταν αναγκαστικά υπεύθυνη για τη μετατροπή του CBDA σε THCA, δεν έχει ποτέ ανιχνευθεί σε καμία ενζυμική ανάλυση που χρησιμοποιεί ακατέργαστα εκχυλίσματα ενζύμου φυτού C. sativa. Η τρέχουσα σκέψη προτείνει ότι προέρχεται από το CBGA αντ’ αυτού είτε από συνθάση τετραϋδροκανναβινολικού οξέος (THCAS) είτε από συνθάση κανναβιδιολικού

οξέος (cannabidiolic acid synthase, CBDAS) και τα δύο μέλη της σούπερ οικογένειας της π-κρεσόλης μεθυλ-υδροξυλάσης (p-cresol methyl-hydroxylase) (Taura et al. 2007, Shoyama et al. 2012).

Δομική και μηχανιστική φύση των TKS, OAC, THCAS και CBDAS

Η κρυσταλλική δομή της TKS κυκλοφόρησε πρόσφατα από τους Kearsey et al. το 2019 (PDBID:6GW3) (Εικ.3a) (Kearsey et al. 2020). Δύο διμερή εμπλέκονται στην ασύμμετρη μονάδα και δεν υπάρχει σημαντική διαφορά στη διαμόρφωση μεταξύ των τεσσάρων μονομερών. Το μόνιμο CoA σχηματίζει πέντε δεσμούς υδρογόνου με υπολείμματα CDS157, LEU261, GLU299, LYS301 και ALA302 (Εικ.3a). Η ενεργή θέση είναι εύλογα εύκαμπτη ώστε να είναι συμβατή με ένα αναπτυσσόμενο υπόστρωμα πολυκετιδίου. Ο συνδέτης CoA βρίσκεται με το άτομο θείου κοντά στο καταλυτικό Cys157, το οποίο οξειδώθηκε στο σουλφινικό οξύ κατά την κρυστάλλωση. Το υποτιθέμενο καταλυτικό μόριο νερού συντονίζεται και με τα Ser332, CSD157 και επίσης αλληλεπιδρά με άλλα μόρια νερού.

Αν και η κρυσταλλική δομή της πλήρους πρωτεΐνης δεν είναι διαθέσιμη, δομικά δεδομένα από μια περικομμένη OAC και το δυαδικό σύμπλοκο του OAC-OLA, που υπάρχει ως ομοδιμερές, έχουν αναφερθεί από τους Yang et al. (Εικ.3b) (Yang et al. 2016). Η κοιλότητα της ενεργού θέσης της OAC ενσωματώνει 18 υπολείμματα. Εννέα από αυτά σχηματίζουν μια μακρά υδρόφοβη σήραγγα, τον θύλακα δέσμευσης πεντυλίου, βαθιά μέσα στην κοιλότητα της ενεργού θέσης για να φιλοξενήσει επιλεκτικά την πεντυλική αλυσίδα του OLA (Εικ.3b), διασφαλίζοντας ότι το διυδροξυ-βενζοϊκό τμήμα του OLA κάθεται στη είσοδο της κοιλότητας της ενεργού θέσης. Τα Tyr72 και His78 της OAC σχηματίζουν αλληλεπιδράσεις Η-δεσμού και π-π αντίστοιχα με το OLA και επίσης δρουν ως καταλύτες οξέος και βάσης για να βοηθήσουν την κυκλοποίηση.

Η σύνδεση των μελετών του τετρα-β-κετιδίου του πεντυλίου CoA στη δομή OAC ανέδειξε ότι τα His78 και Tyr72 εμπλέκονται στον καταλυτικό μηχανισμό. Οι Yang et al. (2016) πρότειναν ότι το His78 αποπρωτονίζει τον άνθρακα C2 του 4,1 και στη συνέχεια πρωτονίζει το οξυγόνο C7 στο 4,2 για να καταλύσει την επιθυμητή κυκλοποίηση αλδόλης στο 4,3 (Εικ.4). Το Tyr72 ενεργοποιεί την πλευρική αλυσίδα του His78 (μέσω αποπρωτονίωσης) και το θειοεστερικό καρβονυλ οξυγόνο του υποστρώματος (μέσω δεσμών υδρογόνου). Δεν παρατηρήθηκαν υπολείμματα, ιόντα μετάλλου ή μόρια νερού που μπορεί να εμπλέκονται στη διάσπαση και την αρωματοποίηση του θειοεστερικού δεσμού στη δομή του δυαδικού συμπλέγματος OAC-OA. Αυτό υποδηλώνει ότι η OAC στερείται δράσεων θειοεστεράσης και αρωματάσης. Η OAC συνεπώς χρησιμοποιεί τυπική καταλυτική χημεία οξέος/βάσης για το σχηματισμό του προδρόμου 4,3, ο οποίος στη συνέχεια διαχωρίζεται από το ένζυμο και αρωματοποιείται και υδρολύεται για να παρέχει OLA (Yang et al. 2016).

Εικ.4

Προτεινόμενος μηχανισμός για τον σχηματισμό του ελαιοβετολικού οξέος (OLA) από την κυκλάση του ελαιοβετολικού οξέος (OAC)

Το 1995, οι Taura και συνεργάτες εντόπισαν πειραματικά μια νέα μονομερή οξειδορεδουκτάση 76 kDa, την THCAS, που μετατρέπει το CBGA σε THCA (Taura 2009, Taura et al. 1995) όταν το CBGA υποβλήθηκε σε επεξεργασία με εκχύλισμα νεαρών φύλλων, παρήχθησαν υψηλά επίπεδα THCA. Η ομάδα Taura παρήγαγε μια αλληλουχία cDNA για να απλοποιήσει τη μελέτη της μέσω ετερόλογης έκφρασης, το πρώτο ένζυμο που εμπλέκεται στη βιοσύνθεση της κάνναβης που θα κλωνοποιηθεί. των οποίων αποτελούν το πεπτίδιο σήματος (Sirikantaramas et al. 2004). Ως επέκταση αυτής της προσπάθειας, ανέπτυξαν ένα φιλικό προς τη ζύμωση σύστημα έκφρασης για την THCAS, μια απαίτηση για τη βιοτεχνολογική παραγωγή της Δ9-THC (Sirikantaramas et al. 2004, Taura et al. 2007c). Αυτό το όραμα έχει υλοποιηθεί πλήρως από την πρόσφατη εργασία του Keasling που επιτρέπει την πρόσβαση κανναβινοειδών από ζυμομύκητες (Luo et al. 2019).

Το 2012 οι Kuroki & Morimoto ανέφεραν μια κρυσταλλική δομή ακτίνων Χ της συνθετάσης THCA που παρέχει σημαντική μηχανιστική εικόνα: η ενεργή θέση κλειδώνει το FAD στη θέση του μέσω δύο ομοιοπολικών δεσμών με His114 και Cys176 (Εικ.3c) (Shoyama et. al. 2012). Αυτή η ομοιοπολική ακινητοποίηση υποστηρίζεται από μια σειρά βασικών δεσμών Η με 10 επιπλέον υπολείμματα, καθιστώντας το FAD μόνιμο χαρακτηριστικό του ενζύμου. αυτός ο συνδέτης, κατά μήκος της δισουλφιδικής γέφυρας Cys37-Cys99, οδηγεί τη σωστή αναδίπλωση της υπόλοιπης ενεργού θέσης. Αυτά συνδυάζονται για να ακινητοποιήσουν το CBGA για να διευκολύνουν τη μεταφορά υδριδίου στο FAD δημιουργώντας μια επίσημη εναντιοειδική ετερο-αντίδραση Diels-Alder (Zirpel 2018), αν και ο μηχανισμός πιθανότατα προχωρά μέσω μιας τυπικής ιοντικής οδού καρβοκατιόντος (Εικ.5a).

Εικ. 5

Μηχανισμός αντίδρασης για τη μετατροπή του κανναβιγερολικού οξέος (CBGA) σε τετραϋδροκανναβινολικό οξύ (THCA) που προτάθηκε από τους Taura και συνεργάτες (2019), (a) ένα ομοιοπολικά ενσωματωμένο δινουκλεοτίδιο αδενίνης φλαβίνης (flavin adenine dinucleotide, FAD) σε μαύρο χρώμα, (b) η οδός συνθάσης THCA εμφανίζεται με πράσινο και (c) η οδός συνθάσης κανναβιδιολικού οξέος (CBDA) εμφανίζεται με μωβ. CBDA και THCA με κόκκινο χρώμα. Το κόκκινο πλαίσιο αντιπροσωπεύει την ενεργή θέση του ενζύμου

Η CBDAS είναι ένα πολυπεπτίδιο 517 αμινοξέων με θεωρητική μάζα 59 kDa, αν και δεν έχει ληφθεί κρυσταλλική δομή (Taura et al. 2007B, Lercker et al. 1992). Πειραματικά, έχει ανιχνευθεί ως πρωτεΐνη 74 kDa, πιθανώς αποτέλεσμα μεταμεταφραστικής Ν-γλυκοζυλίωσης επτά υπολειμμάτων Asn (Taura et al. 2007b, Taura et al. 1996). Όπως η THCAS, η CBDAS είναι επίσης ένα φλαβινοποιημένο ένζυμο. Τα His114 και Cys176 είναι οι πιο πιθανές θέσεις δέσμευσης FAD με βάση την αναλογία με την THCAS. Ο Morimoto έχει προτείνει ότι ο μηχανισμός των δύο ενζύμων είναι πιθανότατα πολύ παρόμοιος (Taura et al. 2007b). Η ομάδα Morimoto πρότεινε ότι η σημαντική διαφορά μεταξύ του κύριου τρόπου δράσης τους είναι στο βήμα μεταφοράς πρωτονίων: η CBDAS αφαιρεί ένα πρωτόνιο από την τερματική ομάδα μεθυλίου του CBGA αντί από την ομάδα υδροξυλίου που στοχεύει η THCAS, αυτή η αλλαγή στην τοποεπιλεκτικότητα καθορίζει την κυκλοποίηση (Εικ.5b,c) (Taura et al. 2007B, Taura et al. 2019).

Παρά αυτή τη μικρή διαφορά στον μηχανισμό, η THCAS και η CBDAS έχουν 84% ταυτότητα αλληλουχίας (Taura et al. 2007b), με μεταλλάξεις σε υπολείμματα βασικών ενεργών θέσεων πιθανώς να εξηγούν τη διαφορετική εξειδίκευσή τους στην κυκλοποίηση (Εικ.6a) (Onofri et al. al. 2015). Και οι δύο παράγουν οκτώ διαφορετικά προϊόντα, αν και σε διαφορετικές αναλογίες. Ενώ η THCAS παράγει CBDA και CBCA ως δευτερεύοντα προϊόντα, η CBDAS παράγει μικρές ποσότητες THCA και CBCA επιπλέον του CBDA (Εικ.6b) (Zirpel et al. 2018). Αυτή η ομοιότητα μπορεί να αξιοποιηθεί και μια απλή σημειακή μετάλλαξη, το A414V στην THCAS αποδίδει ένα ανάλογο με τριπλάσια καταλυτική δραστηριότητα για την παραγωγή CBDA από την THCAS, αλλά και με 19 φορές υψηλότερη παραγωγή THCA και διευρυμένο φάσμα pH για την παραγωγή CBDA, THCA και CBCA (Zirpel et al. 2018).

Εικ. 6

Σύγκριση της συνθάσης του κανναβιδιολικού οξέος (CBDAS) και της συνθάσης του τετραϋδροκανναβινολικού οξέος (THCAS) και του μεταβολισμού των κανναβινοειδών. (a) Ένα μοντέλο ομολογίας της CBDAS που αναπτύχθηκε από την THCAS (3VTE). Τα υπολείμματα που διατηρούνται από την THCAS είναι μωβ ενώ τα υπολείμματα παραλλαγής είναι σε κυανό, οι εισαγωγές αλληλουχίας είναι κόκκινες και το FAD είναι πράσινο, (b) ενεργό σημείο αυτών των ενζύμων που επισημαίνεται με μια γελοιογραφία που δείχνει τη μετατροπή σε τετραϋδροκανναβινολικό οξύ (THCA), κανναβιδιολικό οξύ (CBDA) και κανναβιχρωμενικό οξύ (CBCA) από κανναβιγερολικό οξύ (CBGA), (c) πειραματικά αποδεδειγμένες αντιδράσεις οξείδωσης (ox) και ισομερισμού (is) και μεταβολικές μοίρες (encircled) για Δ9-THCA και Δ9-τετραϋδροκανναβινόλη (Δ9-THC)

Πρόσφατα η αλληλουχία της CBCAS αναφέρθηκε από τους Page & Stout (2019). Η ταυτότητα αλληλουχίας μεταξύ CBDAS και THCAS είναι σχεδόν ταυτόσημη: 96% (van Bakel et al. 2011). Ο Morimoto είχε προηγουμένως καθαρίσει το ένζυμο σε εμφανή ομοιογένεια, αλλά αυτή η αλληλουχία δεν είναι ακόμη διαθέσιμη σε δημόσιες βάσεις δεδομένων (Morimoto et al. 1998). Η CBCAS απομονώθηκε και καθαρίστηκε μερικώς από νεαρά φύλλα C. sativa (Morimoto et al. 1998, Morimoto et al. 1997). Σε αντίθεση για τις CBDAS και THCAS, η CBCAS φαίνεται να είναι ομοδιμερές με καθορισμένη φυσική μοριακή μάζα 136 kDa και μέγιστη δραστικότητα σε pH 6,5. Μια μοριακή μάζα 71 kDa υπολογίστηκε για τα μονομερή χρησιμοποιώντας SDS-PAGE. Σύμφωνα με κινητικά δεδομένα, η CBCAS έχει υψηλότερη συγγένεια για το CBGA από ότι η THCAS και η CBCAS (Morimoto et al. 1998). Το CBCA και η ουδέτερη μορφή του CBC είναι και τα δύο ρακεμικά. Μελέτες από τον Morimoto πρότειναν ότι και τα δύο εναντιομερή του CBCA σχηματίζονται από μια καταλυόμενη αντίδραση με CBCAS σε μοριακή αναλογία 5:1 (Morimoto et al. 1997). Αλλά είναι ακόμα άγνωστο ποιο από τα δύο ισομερή είναι το κύριο προϊόν (Taura et al. 2007A, Morimoto et al. 1997, Gaoni & Mechoulam 1971). Απομένει πολύ δουλειά να γίνει για την καλύτερη κατανόηση αυτού του ενζύμου.

Αποκαρβοξυλίωση κανναβινοειδών οξέων

Τα ουδέτερα κανναβινοειδή, όπως η Δ9-THC και η CBD, δεν εμφανίζονται σε σημαντικές συγκεντρώσεις στα φυτά, αλλά είναι εύκολα προσβάσιμα με μη ενζυματική θερμική αποκαρβοξυλίωση όταν εκτίθενται στο φως ή τη θερμότητα μέσω του καπνίσματος ή του ψησίματος (Tan et al. 2018). Για να χαρακτηριστεί η αποκαρβοξυλίωση, απαιτούνται ευαίσθητες αναλυτικές μέθοδοι για την ποσοτικοποίηση, σε πραγματικό χρόνο, των συγκεντρώσεων τόσο των οξέων όσο και των ουδέτερων κανναβινοειδών στη σύνθετη μήτρα τους (Wang et al. 2016). Η θερμοκρασία και η διάρκεια θέρμανσης είναι πολύ σημαντικές: η υπερθέρμανση αποσυνθέτει απευθείας τα κανναβινοειδή και οι παρατεταμένοι χρόνοι αντίδρασης προκαλούν παράπλευρες αντιδράσεις, συμπεριλαμβανομένης της υπεροξείδωσης, της μείωσης της απόδοσης και της αύξησης του προφίλ ακαθαρσιών (Εικ.6c). Οι χημικές αναλύσεις αναφέρονται συνήθως ως το άθροισμα της όξινης και της ουδέτερης μορφής των κανναβινοειδών. Επιπλέον, τα επίπεδα THC αναφέρονται ως συνδυασμός επιπέδων THC και CBN καθώς τα ίδια, το Δ9-THCA και η Δ9-THC οξειδώνονται εύκολα αντίστοιχα σε CBNA και κανναβινόλη (CBN) (Εικ.6c) με θερμότητα, οξυγόνο και φως (Moreno-Sanz 2016, Pellati et al. 2018, Dussy et al. 2005). Αυτά τα επίπεδα μετρώνται κυρίως χρησιμοποιώντας χρωματογραφία αερίου ή υγρού (GC και LC) (Wang et al. 2016). Με βάση το έργο πολλών αναλυτικών μελετών που χρησιμοποιούν αέρια και υγρή χρωματογραφία τα τελευταία χρόνια (για μια λεπτομερή ανασκόπηση των συνεισφορών διαφόρων συγγραφέων, δες το SI, Εικ. S2 και S3), ο τρέχων προτεινόμενος μηχανισμός για θερμική αποκαρβοξυλίωση επικαλείται ένα ενδομοριακό υδρογόνο δεσμεύεται με την ορθο-φαινόλη (Εικ.S4) και φαίνεται να αποτελεί κοινό στοιχείο για αυτήν τη σειρά 2-υδροξυβενζοϊκών οξέων (Perrotin-Brunel et al. 2011).

Σταθερότητα και παραγωγοποίηση των THC και THCA

Όπως συζητήθηκε, το Δ9-THCA και η Δ9-THC οξειδώνονται εύκολα σε CBNA και CBN παρουσία οξυγόνου και φωτός κατά τη διάρκεια της θερμικής αποκαρβοξυλίωσης ή ακόμα και γήρανσης (Εικ.6c) (Moreno-Sanz 2016, Pellati et al. 2018, Dussy et al. 2005) με τον ίδιο τρόπο, κατά την αποθήκευση ή κατά την αποκαρβοξυλίωση, η Δ9-THC μπορεί επίσης να οξειδωθεί σε ένα ισομερές γνωστό ως Δ8-THC, το οποίο είναι ένα τεχνούργημα της διαδικασίας γήρανσης (Pellati et al. 2018). Καθώς η αποκαρβοξυλίωση είναι μόνο μερική, το THCA μπορεί να βρεθεί, μαζί με την Δ9-THC, στο στοματικό υγρό, τον ορό και τα ούρα των καταναλωτών κάνναβης (Dussy et al. 2005, Jung et al. 2007, Moore et al. 2007). Αυτό μπορεί να χρησιμοποιηθεί ιατροδικαστικά, καθώς το THCA δεν μετατρέπεται σε Δ9-THC in vivo, εμφανίζοντας τις δικές του οδούς μεταβολισμού και αποβολής (Εικ.6c). Κατά συνέπεια, η παρουσία THCA κάνει διάκριση μεταξύ της χρήσης φυτικής κάνναβης και της συνταγογραφούμενης συνθετικής Δ9-THC, πχ. Marinol® (Jung et al. 2009, Raikos et al. 2014). Αν και εξακολουθεί να είναι σχετικό σε δικαιοδοσίες που εφαρμόζουν την απαγόρευση, αυτό είναι πιθανό να γίνει πολύ λιγότερο σημαντικό καθώς η νομιμοποίηση εξαπλώνεται.

Το 1970, οι Agurell et al. επιβεβαίωσαν την ύπαρξη όξινων μεταβολιτών της Δ9-THC (Agurell et al. 1970). Οι συγγραφείς έκαναν ένεση ραδιοσημασμένης Δ9-THC σε κουνέλια. Η ανάλυση ούρων επιβεβαίωσε την παρουσία 11-νορ-9-καρβοξυ-δέλτα 9-THC (11-nor-9-carboxy-delta 9-THC, THC-COOH) (Εικ.6c). Η THC-COOH δεν παράγει ψυχοτρόπες αποκρίσεις στους ανθρώπους και μεταβολίζεται περαιτέρω σε συζυγή γλυκουρονιδίου (Wall & Perez-Reyes 1981). Η THC-COOH δεν προκαλεί κανναβιμιμητικές συμπεριφορές σε ποντίκια και δεν δείχνει συγγένεια για τον υποδοχέα CB1 (Martin et al. 1995). Ένα σχετικό καρβοξυλικό παράγωγο της THC (ανάλογο καρβοξυλικού οξέος της Δ9-THC, Εικ.6c) απομονώθηκε από φυτά C. sativa υψηλής δραστικότητας (Husni et al. 2014). Αυτή η ένωση, που λανθασμένα αναφέρεται ως Δ9-THC, εμφάνισε χαμηλή συγγένεια (στην περιοχή mM) και για τους υποδοχείς CB1 και CB2. Αυτό συμφωνεί με μια προηγούμενη αναφορά, όπου το Δ9-THCA συντέθηκε ως μέρος μιας μελέτης σχέσης δομής-δραστηριότητας που διεξήχθη στη θέση C-1 της Δ9-THC (Burdick et al. 2010). Η ανάλυση των μεταβολιτών των άλλων κανναβινοειδών δεν έχει μελετηθεί εκτενώς και θα μπορούσε να αποδειχθεί καρποφόρα. Ωστόσο, η χαμηλή συγγένεια των καρβοξυλιωμένων κανναβινοειδών για τους υποδοχείς τους πιθανώς υποδηλώνει ότι θα είναι ανενεργά σε αυτό το μονοπάτι.

Τελικές παρατηρήσεις και μελλοντικές προοπτικές

Αν και έχει καταβληθεί μεγάλη προσπάθεια για τη διερεύνηση της βιοσύνθεσης των κανναβινοειδών και των μηχανισμών αποκαρβοξυλίωσης και μεταβολισμού τους, πολλά παραμένουν ασαφή. Δεν έχουμε ακόμη δομικά δεδομένα για πολλά από τα ένζυμα που εμπλέκονται και έχουμε λίγες πληροφορίες σχετικά με τον τρόπο παρασκευής των περίπου 200 διαφορετικών κανναβινοειδών, για το καθένα. Σε μεγαλύτερη κλίμακα, ο σχετικός ρόλος και το προφίλ γονιδιακής έκφρασης των διαφορετικών τριχωμάτων στο φυτό δεν είναι κατανοητό. Η έρευνα για τη φυσιολογική δραστηριότητα της κάνναβης έχει περιοριστεί σε μεγάλο βαθμό στην THC και την CBD, αλλά υπάρχουν σαφείς ενδείξεις ότι ορισμένες από τις επιδράσεις προκύπτουν από τα άλλα κανναβινοειδή. Καθώς η υπόσχεσή τους για θεραπευτικά αποτελέσματα γίνεται όλο και πιο ξεκάθαρη, θα χρειαστούμε μια καλύτερη κατανόηση αυτών των μονοπατιών, ώστε να μπορέσουμε να τα ανασχεδιάσουμε, είτε στο φυτό είτε σε έναν ανασυνδυασμένο φορέα, για την επιλεκτική τους παραγωγή. Σημειώθηκε αξιοσημείωτη πρόοδος τις τελευταίες δύο δεκαετίες στη χημεία των φυσικών προϊόντων κανναβινοειδών, αλλά απομένει πολύ δουλειά να γίνει για να επιτευχθεί ο στόχος της παραγωγής επιλεγμένων κανναβινοειδών σε υψηλές ποσότητες και καθαρότητα τόσο για θεραπευτικούς όσο και για ψυχαγωγικούς σκοπούς.

Συμπληρωματικές πληροφορίες

Πίνακας S1

Ταξινόμηση των κύριων κανναβινοειδών με βάση τη χημική τους φύση που ανακαλύφθηκαν από το φυτό C. sativa L. και αλλαγή στον αριθμό τους από το 2005 έως το 2015.

Εικ.S1

Οι τρεις τύποι αδενικών τριχωμάτων που βρίσκονται στα θηλυκά άνθη κάνναβης, (α) μεγεθυμένα τριχώματα από το θηλυκό φυτό, (β) σχηματική απεικόνιση τριχώματος με μίσχο που δείχνει διαφορετικές περιοχές και αποθήκευση κανναβινοειδών, (γ-ε) εικόνες κρυο-SEM των τριών τύπων αδενικών τριχωμάτων κάνναβης, ταξινομημένα ως με μίσχο (γ), άμισχα (δ) και βολβώδες (ε), ράβδοι κλίμακας 20 μμ.

Τα πάνελ c-e αναπαράγονται από τους Livingston et al. 2020.

Το πλαίσιο Α αναπαράγεται με άδεια.

Αναλυτικά Εργαλεία για την Ανάλυση Κάνναβης

Το GC είναι μια σχετικά απλή τεχνική για τη μελέτη της αποκαρβοξυλίωσης και είναι ιδανική στις περισσότερες περιπτώσεις, ειδικά για κανναβινοειδή χαμηλού μοριακού βάρους (280–360 gmol^-1). Ωστόσο, ο κύριος περιορισμός της περιλαμβάνει την απαραίτητη θέρμανση του δείγματος, επομένως, δεν μπορεί να χρησιμοποιηθεί για τον ποσοτικό προσδιορισμό των ασταθών οξέων καθώς αποκαρβοξυλιώνονται υπό τις συνθήκες. Η Υγρή Χρωματογραφία Υψηλής Απόδοσης (High Performance Liquid Chromatography, HPLC) είναι αποτελεσματική και για τις δύο κατηγορίες, αλλά έχει το δικό της σύνολο μειονεκτημάτων. Οι Raharjo & Verpoorte εξέτασαν διαφορετικές μεθόδους που αναφέρθηκαν HPLC για ανάλυση κανναβινοειδών και κατέληξαν στο συμπέρασμα ότι οι περισσότερες δεν ήταν ούτε επικυρωμένες ούτε συμβατές με κανονισμούς και ότι πολλά δεν παρείχαν καθαρό διαχωρισμό των κύριων κανναβινοειδών χωρίς αλληλεπικαλυπτόμενες κορυφές. Για να ξεπεραστούν τα μειονεκτήματα κάθε τεχνικής, οι Hazekamp και συνεργάτες προτείνουν το συνδυασμό HPLC με δευτερεύουσα ανάλυση με GC ως μέθοδο για τον ποσοτικό προσδιορισμό τόσο της καρβοξυλιωμένης όσο και της αποκαρβοξυλιωμένης μορφής όλων των κύριων κανναβινοειδών σε μία μόνο εξέταση, μια ενιαία ανάλυση, ωστόσο η MS δεν είναι συνήθως διαθέσιμη σε όλα τα βιομηχανικά και ακαδημαϊκά εργαστήρια.

Αναλυτική συζήτηση σχετικά με τον μηχανισμό της αποκαρβοξυλίωσης. Για τη μελέτη της αποκαρβοξυλίωσης των CBDA και THCA, οι Veress et al. θέρμαναν αποξηραμένα εκχυλίσματα σε ανοιχτό αντιδραστήρα σε ένα εύρος θερμοκρασιών και χρόνων και αναλύθηκαν τα δείγματα με HPLC. Τα αποτελέσματα υποδεικνύουν ότι η πλήρης αποκαρβοξυλίωση του Δ9-THCA σε Δ9-THC επιτεύχθηκε σε 5-10 λεπτά στους 145°C. Οι μεγαλύτεροι χρόνοι θέρμανσης προκάλεσαν σημαντική απώλεια, πιθανώς λόγω της εξάτμισης της Δ9-THC σε ανοιχτό αντιδραστήρα και από πλευρικές αντιδράσεις. Για να ελαχιστοποιηθεί αυτή η απώλεια που προκαλείται από μεγαλύτερη θέρμανση, οι Dussy και συνεργάτες θέρμαιναν καθαρό THCA σε φούρνο για καθορισμένο χρόνο 15 λεπτά στους 120°C, 140°C, 160°C και στους 180°C. Η αποκαρβοξυλίωση προχώρησε στους 160°C. Ωστόσο, ο σχηματισμός ενός προϊόντος οξείδωσης, της κανναβινόλης (CBN), παρατηρήθηκε στους 160°C και 180°C. Σε αυτή τη μελέτη, το μοριακό άθροισμα των Δ9-THC και THCA, που μετρήθηκε με HPLC, ήταν πάντα υψηλότερο από αυτό της Δ9-THC όπως μετρήθηκε με GC, υποδεικνύοντας ατελή αποκαρβοξυλίωση και μετατροπή που δεν ξεπερνούσε ποτέ το 70%. Οι συγγραφείς πρότειναν ότι αυτή η διαφορά προέκυψε από το σχηματισμό αποικοδομημένου πολυμερούς υλικού κατά τη θερμική αποκαρβοξυλίωση με βάση το γεγονός ότι το άθροισμα των Δ9-THCA, Δ9-THC και κανναβινόλης (CBN) δεν φτάνει ποτέ το 100% της αρχικής τιμής. Στην ίδια έκθεση, χρησιμοποίησαν GC για να μελετήσουν την αποκαρβοξυλίωση του Δ9-THCA in situ, χρησιμοποιώντας τη θερμότητα του οργάνου για να ξεκινήσει η αποκαρβοξυλίωση, μιμούμενοι τις συνθήκες καπνίσματος. Ωστόσο, οι αποδόσεις ήταν μέτριες, με τη μετατροπή να κορυφώνεται στο 65% στους 225ºC, το καλύτερο σύνολο συνθηκών: σε υψηλότερες θερμοκρασίες (πχ. 300°C), οι αποδόσεις έπεσαν κατακόρυφα. Αντίθετα, οι Hewavitharana et al. ανέφεραν πλήρη αποκαρβοξυλίωση των οξέων σε ουδέτερα κανναβινοειδή κάτω από σχετικά απλές συνθήκες: τα πλούσια σε CBD φύλλα ξηράνθηκαν στους 40°C και ακολούθησε εκχύλιση με εξάνιο. Το εκχύλισμα αναλύθηκε με GC-MS χρησιμοποιώντας θερμαινόμενη θυρίδα έγχυσης και κρυσένιο-d12 ως εσωτερικό πρότυπο. Πήραν ένα εύρος γραμμικής βαθμονόμησης που εκτείνεται έως και 40ppm και ένα όριο ανίχνευσης 0,2ng/injection. Υπό αυτές τις συνθήκες, η μετατροπή του CBDA σε CBD ολοκληρώθηκε και δεν παρατηρήθηκε υποβάθμιση. Ωστόσο, όλες αυτές οι μέθοδοι μοιράζονται τον σημαντικό περιορισμό ότι η αποκαρβοξυλίωση που προκαλείται από έγχυση GC είναι ακατάλληλη για κλίμακα παραγωγής.

Αν και η HPLC είναι η προτιμώμενη μέθοδος για τη μελέτη των κανναβινοειδών και της αποκαρβοξυλίωσης τους, μια σημαντική πρόκληση είναι η έλλειψη χρωμοφόρων που σημαίνει ότι έχουν χαμηλή μοριακή απορροφητικότητα. Η ανάλυση UV-vis περιορίζεται σε χαμηλά μήκη κύματος, όπου η ισχυρή απορρόφηση υποβάθρου από τα εκπλυμένα αποτελέσματα στα φτωχά όρια ανίχνευσης. Ωστόσο, αυτό το πρόβλημα μπορεί να ξεπεραστεί αντικαθιστώντας την ανίχνευση UV με φασματομετρία μάζας (HPLC-MS). Αυτή ήταν η προσέγγιση των Wang et al., οι οποίοι προσδιόρισαν ποσοτικά εννέα κανναβινοειδή και οξέα (CBD, Δ8-THC, THCV, Δ9-THC, CBN, CBG, THCA, CBDA και CBGA) πριν και μετά τη θέρμανση των εκχυλισμάτων κάνναβης σε φούρνο κενού σε 80°C, 95°C, 110°C, 130°C και 145°C για έως και 60 λεπτά (Εικ.S3). Όλα τα κανναβινοειδή σε αυτή τη μελέτη αναλύθηκαν με υπερκρίσιμη χρωματογραφία υγρού/μάζα συστοιχίας φωτοδιόδου εξαιρετικά υψηλής απόδοσης φασματόμετρο (UHPSFC/PDA-MS) πριν και μετά την αποκαρβοξυλίωση (Εικ.S3). Η αποκαρβοξυλίωση σε διαφορετικές θερμοκρασίες εμφάνισε μια εκθετική σχέση μεταξύ συγκέντρωσης και χρόνου, υποδεικνύοντας μια αντίδραση πρώτης τάξης ή ψευδο-πρώτης τάξης, όπως θα αναμενόταν για τη μονομοριακή διαδικασία της αυθόρμητης αρωματικής αποκαρβοξυλίωσης. Η σταθερά του ρυθμού αποκαρβοξυλίωσης για το Δ9-THCA προσδιορίστηκε ότι είναι διπλάσια από αυτήν είτε του CBDA είτε του CBGA. Η αποκαρβοξυλίωση THCA ήταν σχεδόν ποσοτική χωρίς να ανιχνευθούν παράπλευρες αντιδράσεις (8% απώλεια στην εξάτμιση). Δεν παρατηρήθηκε CBN, ένα κοινό παραπροϊόν οξείδωσης, υπό τις πειραματικές συνθήκες. Αντίθετα, οι αντιδράσεις αποκαρβοξυλίωσης για το CBDA και το CBGA ήταν πιο περίπλοκες με απροσδιόριστες παράπλευρες αντιδράσεις που αντιστοιχούσαν σε απώλεια 18% (CBDA) έως 53% (CBGA) της μάζας του εκχυλίσματος.

Η κινητική της αποκαρβοξυλίωσης κανναβινοειδών είναι κρίσιμης σημασίας για τη βιομηχανική επεξεργασία. Οι Veress και συνεργάτες ανέφεραν την κινητική της αποκαρβοξυλίωσης ως συνάρτηση της θερμοκρασίας, των διαλυτών, των ροφητικών φάσεων και των προσθέτων το 1990. Ωστόσο, τα αποτελέσματα είναι μόνο ημιποσοτικά λόγω της εξάτμισης και της αποικοδόμησης των αναλυτών. Η Perrotin-Brunel ηγήθηκε μιας ομάδας που επανεξέτασε αυτό το ερώτημα το 2011, συνδυάζοντας ανάλυση HPLC με μοριακή μοντελοποίηση για τη μέτρηση των ρυθμών αποκαρβοξυλίωσης THCA σε στερεά κατάσταση, υπό κενό. Δείγματα συλλέγονταν κάθε 5 λεπτά για την πρώτη ώρα και στη συνέχεια κάθε μισή ώρα μέχρι να ολοκληρωθεί η μετατροπή του Δ9-THCA σε Δ9-THC. Υπό τις πειραματικές συνθήκες, η υψηλότερη μετατροπή και απόδοση σε Δ9-THC επιτεύχθηκε στους 110 °C μετά από 110 λεπτά, κάτι που είναι σύμφωνο με τα ποιοτικά ευρήματα των Veress et al. Η αντίδραση στερεάς κατάστασης υπακούει σε έναν νόμο ρυθμού πρώτης τάξης, όπως αναμενόταν. Το αποκορύφωμα αυτής της εργασίας ήταν ότι ήταν η πρώτη προσπάθεια μελέτης της κινητικής και της αποκαρβοξυλίωσης σε πραγματικό χρόνο, σε αντίθεση με τις περισσότερες από τις προηγούμενες εργασίες που διεξήχθησαν είτε σε κλειστούς αντιδραστήρες, οι οποίοι δεν επιτρέπουν δειγματοληψία, είτε σε ανοιχτούς αντιδραστήρες και σε γυάλινη επιφάνεια, που προκάλεσε απώλεια υλικού. Οι συγγραφείς πρότειναν ψευδο-πρώτης τάξης μηχανισμό κετοενόλης που καταλύεται από οξύ για τη διαδικασία αποκαρβοξυλίωσης, οι υπολογιστικοί υπολογισμοί είναι συνεπείς με αυτόν τον μηχανισμό. Για απλότητα, τόσο οι πειραματικές όσο και οι υπολογιστικές μελέτες πραγματοποιήθηκαν χρησιμοποιώντας 2-υδροξυβενζοϊκό οξύ (Εικ.S4). υποδεικνύοντας ότι αυτό μπορεί να είναι ένα γενικό χαρακτηριστικό των 2-υδροξυβενζοϊκών οξέων.

Εικ.S2

Χρωματογραφήματα HPLC καταγράφηκαν στα 220 nm για τη μετατροπή του Δ9-THCA σε Δ9-THC σε διαφορετικές θερμοκρασίες από τους Dussy και συνεργάτες. Σε υψηλότερες θερμοκρασίες (160 °C, 180 °C), η Δ9-THC οξειδώνεται για να σχηματίσει κανναβινόλη, Αναπαράγεται από Dussy et al. 2005.

Εικ.S3

(a) Χρωματόγραμμα UHPSFC/PDA (220 nm) ενός τυπικού μείγματος στανταρ κανναβινοειδών. Σειρά: (1) CBD, (2) Δ8-THC, (3) THCV, (4) Δ9-THC, (5) CBN, (6) CBG, (7) THCA, (8) CBDA, (9) CBGA (βλ. λίστα συντομογραφιών στο τέλος του άρθρου για επεξήγηση, (b) συγκέντρωση (mM) THCA, (c) Δ9-THC (d) CBDA και (e) CBD ως συνάρτηση του χρόνου και της θερμοκρασίας. Σχήματα που αναπαράγονται από τον Wang et al. 2016.

Εικ.S4

Αποκαρβοξυλίωση του 2-υδροξυβενζοϊκού οξέος μέσω ενός ενδιάμεσου β-κετοξέος όπως προτείνεται από τους Perrotin-Brunel.

1. Livingston, S. J.; Quilichini, T. D.; Booth, J. K.; Wong, D. C. J.; Rensing, K. H.; Laflamme-Yonkman, J.; Castellarin, S. D.; Bohlmann, J.; Page, J. E.; Samuels, A. L., Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. Plant J. 2020, 101 (1), 37-56.

2. De Backer, B.; Debrus, B.; Lebrun, P.; Theunis, L.; Dubois, N.; Decock, L.; Verstraete, A.; Hubert, P.; Charlier, C., Innovative development and validation of an HPLC/DAD method for the qualitative and quantitative determination of major cannabinoids in cannabis plant material. J. Chromatogr. B: Anal. Technol. Biomed. Life Sci. 2009, 877 (32), 4115-4124.

3. Raharjo, T. J.; Verpoorte, R., Methods for the analysis of cannabinoids in biological materials: a review. Phytochem. Anal. 2004, 15 (2), 79-94.

4. Hazekamp, A.; Peltenburg, A.; Verpoorte, R.; Giroud, C., Chromatographic and spectroscopic data of cannabinoids from Cannabis sativa L. J. Liq. Chromatogr. Relat. Technol. 2005, 28 (15), 2361-2382.

5. Veress, T.; Szanto, J. I.; Leisztner, L., Determination of cannabinoid acids by high-performance liquid chromatography of their neutral derivatives formed by thermal decarboxylation: I. Study of the decarboxylation process in open reactors. J. Chromatogr. A 1990, 520, 339-347.

6. Dussy, F. E.; Hamberg, C.; Luginbühl, M.; Schwerzmann, T.; Briellmann, T. A., Isolation of Δ9-THCA-A from hemp and analytical aspects concerning the determination of Δ9-THC in cannabis products. Forensic Sci. Int. 2005, 149 (1), 3-10.

7. Hewavitharana, A. K.; Golding, G.; Tempany, G.; King, G.; Holling, N., Quantitative GC-MS analysis of Δ9-tetrahydrocannabinol in fiber hemp varieties. J. Anal. Toxicol. 2005, 29 (4), 258-261.

8. Wang, M.; Wang, Y.-H.; Avula, B.; Radwan, M. M.; Wanas, A. S.; Antwerp, J. v.; Parcher, J. F.; ElSohly, M. A.; Khan, I. A., Decarboxylation study of acidic cannabinoids: A novel approach using ultra-high-performance supercritical fluid chromatography/photodiode array-mass spectrometry. Cannabis Cannabinoid Res. 2016, 1 (1), 262-271.

9. Perrotin-Brunel, H.; Buijs, W.; Spronsen, J. v.; Roosmalen, M. J. E. v.; Peters, C. J.; Verpoorte, R.; Witkamp, G.-J., Decarboxylation of Δ9-tetrahydrocannabinol: Kinetics and molecular modeling. J. Mol. Struct. 2011, 987 (1), 67-73.

10. Kanter, S. L.; Musumeci, M. R.; Hollister, L. E., Quantitative determination of Δ9-tetrahydrocannabinol and Δ9-tetrahydrocannabinolic acid in marihuana by high-pressure liquid chromatography. J. Chromatogr. 1979, 171, 504-8.

11. Smith, R. N.; Vaughan, C. G., High-pressure liquid chromatography of cannabis. Quantitative analysis of acidic and neutral cannabinoids. J. Chromatogr. 1976, 129, 347-54.

Ευχαριστίες

Αυτή η εργασία χρηματοδοτήθηκε εν μέρει από το Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (NSERC) μέσω των επιχορηγήσεων Discovery (RGPIN: 2017-06611-SRG; 2018-06338-JFT), της Arthritis Society (STAR Career Development Award-JFT (19-0451) και ένα βραβείο MITACS IT16195 στους SRG και JFT. Τόσο ο JFT όσο και ο SRG, επίσης αναγνωρίζουν τη Faculty of Science and the Department of Chemistry and Biochemistry του University of Windsor για την υποστήριξη. Οι συγγραφείς θα ήθελαν να ευχαριστήσουν τη Sanaz Seifi για τη βοήθεια στην προετοιμασία του γραφικού TOC/Εικ.S1b.

Συνεισφορές συγγραφέων

Conceptualization, M.N.T., S.R.-G., J.F.T.; Investigation M.N.T. and F.S.; Writing – Original Draft, M.N.T.; Writing – Review and Editing, M.N.T., F.S., S.R.-G., J.F.T.; Visualization, F.S.; Supervision, S.R.-G., J.F.T.; Funding Acquisition, S.R.-G., J.F.T. Όλοι οι συγγραφείς έχουν δώσει την τελική έγκριση στην τελική έκδοση του χειρογράφου.

Δηλώσεις

Ανταγωνιστικά συμφέροντα

Αυτή η εργασία χρηματοδοτήθηκε έμμεσα από την SofTabs Technologies Inc. μέσω μιας ερευνητικής συμφωνίας MITACS με τους SRG και JFT. Η SofTabs Technologies δεν έπαιξε κανένα ρόλο στη σύλληψη, την προετοιμασία ή την αναθεώρηση αυτού του άρθρου, ούτε την εξέτασε ή την ενέκρινε πριν από τη δημοσίευση της, καθώς το πεδίο της αξιολόγησης δεν εμπίπτει στο πεδίο εφαρμογής της συμφωνίας έρευνας. Η εταιρεία δεν είχε καμία επιρροή στη μεθοδολογία, το πεδίο εφαρμογής ή τα συμπεράσματα του άρθρου.

Υποσημειώσεις

Σημείωση εκδότη

Το Springer Nature παραμένει ουδέτερο όσον αφορά τις διεκδικήσεις δικαιοδοσίας σε δημοσιευμένους χάρτες και θεσμικές σχέσεις.

Πληροφορίες Συντελεστών

Simon Rondeau-Gagné, Email: ac.rosdniwu@uaednors

John F. Trant, Email: ac.rosdniwu@tnartj

Βιβλιογραφικές αναφορές

1. Adams R, Baker BR, Wearn RB. Structure of cannabinol. III. Synthesis of cannabinol, 1-hydroxy-3-n-amyl-6,6,9-trimethyl-6-dibenzopyran. J Am Chem Soc. 1940;62(8):2204–2207. doi:10.1021/ja01865a083.

2. Agurell S, Nilsson IM, Ohlsson A, Sandberg F. Metabolism of cannabis. III. Metabolism of tritium-labeled Δ 1-tetrahydrocannabinol in the rabbit. Biochem. Pharmacol. 1970;19(4):1333–1339.

3. Appendino G, Chianese G, Taglialatela-Scafati O. Cannabinoids: Occurrence and medicinal chemistry. Curr Med Chem. 2011;18(7):1085–1099. doi:10.2174/092986711794940888.

4. Austin MB, Bowman ME, Ferrer J-L, Schröder J, Noel JP. An aldol switch discovered in stilbene synthases mediates cyclization specificity of type III polyketide synthases. Chem Biol. 2004;11(9):1179–1194. doi:10.1016/j.chembiol.2004.05.024.

5. Bohlmann J, Gershenzon J. Old substrates for new enzymes of terpenoid biosynthesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 2009;106(26):10402–10403. doi:10.1073/pnas.0905226106.

6. Booth JK, Bohlmann J. Terpenes in Cannabis sativa – From plant genome to humans. Plant Sci. 2019;284:67–72. doi:10.1016/j.plantsci.2019.03.022.

7. Booth JK, Page JE, Bohlmann J. Terpene synthases from Cannabis sativa. Plos One. 2017;12(3):e0173911. doi:10.1371/journal.pone.0173911.

8. Burdick D, De Orazio R, Guzzo P, Habershaw A, Helle M, Paul B, Wolf M. Synthesis and structure-activity relationship of substitutions at the C-1 position of Δ9-tetrahydrocannabinol. Bioorg Med Chem Lett. 2010;20(4):1424–1426. doi:10.1016/j.bmcl.2009.12.092.

9. Davis EM, Croteau R. Cyclization Enzymes in the Biosynthesis of Monoterpenes, Sesquiterpenes, and Diterpenes. In: Leeper FJ, Vederas JC, editors. Biosynthesis: Aromatic Polyketides, Isoprenoids, Alkaloids. Berlin, Heidelberg: Springer Berlin Heidelberg; 2000. pp. 53–95.

10. De Zeeuw RA, Malingre TM, Merkus FWHM. Δ1-Tetrahydrocannabinolic acid, an important component in the evaluation of cannabis products. J Pharm Pharmacol. 1972;24(1):1–6. doi:10.1111/j.2042-7158.1972.tb08856.x.

11. Dewick PM. Medicinal Natural Products, A Biosynthetic Approach. 2. West Sussex: Wiley; 2002.

12. Dussy FE, Hamberg C, Luginbühl M, Schwerzmann T, Briellmann TA. Isolation of Δ9-THCA-A from hemp and analytical aspects concerning the determination of Δ9-THC in cannabis products. Forensic Sci Int. 2005;149(1):3–10. doi:10.1016/j.forsciint.2004.05.015.

13. Farnsworth NR. Pharmacognosy and chemistry of “Cannabis sativa” J Am Pharm Assoc. 1969;9(8):410–414.

14. FDA, FDA and Cannabis: Research and Drug Approval Process. (n.d.) https://www.fda.gov/news-events/public-health-focus/fda-and-cannabis-research-and-drug-approval-process Accessed 31 Mar 2020.

15. Fellermeier M, Zenk MH. Prenylation of olivetolate by a hemp transferase yields cannabigerolic acid, the precursor of tetrahydrocannabinol. FEBS Lett. 1998;427(2):283–285. doi:10.1016/S0014-5793(98)00450-5.

16. Ferioli V, Rustichelli C, Pavesi G, Gamberini G. Analytical characterization of hashish samples. Chromatographia. 2000;52(1/2):39–44. doi:10.1007/BF02490790.

17. Fischedick JT, Hazekamp A, Erkelens T, Choi YH, Verpoorte R. Metabolic fingerprinting of Cannabis sativa L., cannabinoids and terpenoids for chemotaxonomic and drug standardization purposes. J. Phytochem. 2010;71(17):2058–2073. doi:10.1016/j.phytochem.2010.10.001.

18. Flores-Sanchez IJ, Verpoorte R. Secondary metabolism in cannabis. Phytochem Rev. 2008;7(3):615–639. doi:10.1007/s11101-008-9094-4.

19. Flores-Sanchez IJ, Verpoorte R. Plant polyketide synthases: A fascinating group of enzymes. Plant Physiol Biochem. 2009;47(3):167–174. doi:10.1016/j.plaphy.2008.11.005.

20. Gagne SJ, Stout JM, Liu E, Boubakir Z, Clark SM, Page JE. Identification of olivetolic acid cyclase from Cannabis sativa reveals a unique catalytic route to plant polyketides. Proc Natl Acad Sci U S A. 2012;109(31):12811–12816. doi:10.1073/pnas.1200330109.

21. Gaoni Y, Mechoulam R. Isolation, structure, and partial synthesis of an active constituent of hashish. J Am Chem Soc. 1964;86(8):1646–1647. doi:10.1021/ja01062a046.

22. Gaoni Y, Mechoulam R. Isolation and structure of Δ+- tetrahydrocannabinol and other neutral cannabinoids from hashish. J Am Chem Soc. 1971;93(1):217–24.

23. Ghosh R, Todd AR, Wilkinson S. 264. Cannabis indica. Part V. The synthesis of cannabinol. J Chem Soc. 1940;(0):1393–6.

24. Hallmann-Mikolajczak A. Ebers Papyrus. The book of medical knowledge of the 16th century B.C. Egyptians. Arch Hist Filoz Med. 2004;67(1):5–14.

25. Hammond CT, Mahlberg PG. Morphology of gladular hairs of cannabis sativa from scanning electron microscopy. Am J Bot. 1973;60(6):524–528. doi:10.1002/j.1537-2197.1973.tb05953.x.

26. Hammond CT, Mahlberg PG. Morphogenesis of capitate gladular hairs of Cannabis sativa (cannabaceae) Am J Bot. 1977;64(8):1023–1031. doi:1002/j.1537-2197.1977.tb11948.x.

27. Hampson AJ, Grimaldi M, Axelrod J, Wink D. Cannabidiol and (-)-Δ9-tetrahydrocannabinol are neuroprotective antioxidants. Proc Natl Acad Sci U S A. 1998;95(14):8268–8273. doi:10.1073/pnas.95.14.8268.

28. Hanuš LO, Meyer SM, Muñoz E, Taglialatela-Scafati O, Appendino G. Phytocannabinoids: A unified critical inventory. Nat Prod Rep. 2016;33(12):1357–1392. doi:10.1039/C6NP00074F.

29. Hartsel JA, Eades J, Hickory B, Makriyannis A. Cannabis sativa and hemp. In: Gupta R, editor. Nutraceuticals: Efficacy, safety and toxicity, 1st ed. London: Eslevier: 2016. p. 735-54.

30. Hillig KW. A chemotaxonomic analysis of terpenoid variation in Cannabis. Biochem Syst Ecol. 2004;32(10):875–891. doi:10.1016/j.bse.2004.04.004.

31. Husni AS, McCurdy CR, Radwan MM, Ahmed SA, Slade D, Ross SA, El Sohly MA, Cutler SJ. Evaluation of phytocannabinoids from high-potency Cannabis sativa using in vitro bioassays to determine structure-activity relationships for cannabinoid receptor 1 and cannabinoid receptor 2. Med Chem Res. 2014;23(9):4295–4300. doi:10.1007/s00044-014-0972-6.

32. Jung J, Kempf J, Mahler H, Weinmann W. Detection of Δ9-tetrahydrocannabinolic acid A in human urine and blood serum by LC-MS/MS. J Mass Spectrom. 2007;42(3):354–360. doi:10.1002/jms.1167.

33. Jung J, Meyer MR, Maurer HH, Neusuess C, Weinmann W, Auwaerter V. Studies on the metabolism of the Δ9-tetrahydrocannabinol precursor Δ9-tetrahydrocannabinolic acid A (Δ9-THCA-A) in rat using LC-MS/MS, LC-QTOF MS and GC-MS techniques. J Mass Spectrom. 2009;44(10):1423–1433. doi:10.1002/jms.1624.

34. Kearsey LJ, Prandi N, Karuppiah V, Yan C, Leys D, Toogood H, Takano E, Scrutton NS. Structure of the Cannabis sativa olivetol-producing enzyme reveals cyclization plasticity in type III polyketide synthases. FEBS J. 2019; n/a (n/a).

35. Kearsey LJ, Prandi N, Karuppiah V, Yan C, Leys D, Toogood H, Takano E, Scrutton NS. Structure of the Cannabis sativa olivetol-producing enzyme reveals cyclization plasticity in type III polyketide synthases. FEBS J. 2020;287(8):1511–1524. doi:10.1111/febs.15089.

36. Kenneth Z. Greek and Indian physiognomics. J Am Orient Soc. 2018;138(2):313–325. doi:10.7817/jameroriesoci.138.2.0313.

37. Kinghorn AD, Falk H, Gibbons S, Kobayashi J. Phytocannabinoids, vol. 103. Cham: Springer; 2017.

38. Korte F, Haag M, Claussen U. Tetrahydrocannabinolcarboxylic acid, a component of hashish. Angew Chem Int Ed Engl. 1965;4(10):872. doi:10.1002/anie.196508721.

39. Lastres-Becker I, Molina-Holgado F, Ramos JA, Mechoulam R, Fernandez-Ruiz J. Cannabinoids provide neuroprotection against 6-hydroxydopamine toxicity in vivo and in vitro: Relevance to Parkinson’s disease. Neurobiol Dis. 2005;19(1-2):96–107. doi:10.1016/j.nbd.2004.11.009.

40. Lercker G, Bocci F, Frega N, Bortolomeazzi R. Cannabinoid acids analysis. Farmaco. 1992;47(3):367–378.

41. Lewis MM, Yang Y, Wasilewski E, Clarke HA, Kotra LP. Chemical profiling of medical cannabis extracts. ACS Omega. 2017;2(9):6091–6103. doi:10.1021/acsomega.7b00996.

42. Livingston SJ, Quilichini TD, Booth JK, Wong DCJ, Rensing KH, Laflamme-Yonkman J, Castellarin SD, Bohlmann J, Page JE, Samuels AL. Cannabis glandular trichomes alter morphology and metabolite content during flower maturation. Plant J. 2020;101(1):37–56. doi:10.1111/tpj.14516.

43. Luo X, Reiter MA, d’Espaux L, Wong J, Denby CM, Lechner A, Zhang Y, Grzybowski AT, Harth S, Lin W, Lee H, Yu C, Shin J, Deng K, Benites VT, Wang G, Baidoo EEK, Chen Y, Dev I, Petzold CJ, Keasling JD. Complete biosynthesis of cannabinoids and their unnatural analogues in yeast. Nature. 2019;567(7746):123–126. doi:10.1038/s41586-019-0978-9.

44. Maestro . 2020-4. New York: Schrödinger LLC; 2020.

45. Mahlberg PG, Hammond CT, Turner JC, Hemphill JK. Structure, development and composition of glandular trichomes of Cannabis sativa L. Vancouver: Symposium on Biology and Chemistry of Plant Trichomes, Vancouver, BC, Plenum; 1980. pp. 23–51.

46. Mahlberg PG, Kim ES. Accumulation of cannabinoids in glandular trichomes of Cannabis (Cannabaceae) J Ind Hemp. 2004;9(1):15–36. doi:10.1300/J237v09n01_04.

47. Martin BR, Compton DR, Prescott WR, Barrett RL, Razdan RK. Pharmacological evaluation of dimethylheptyl analogs of Δ9-THC: Reassessment of the putative three-point cannabinoid-receptor interaction. Drug Alcohol Depend. 1995;37(3):231–240. doi:10.1016/0376-8716(94)01081-U.

48. Mechoulam R. Marihuana Chemistry. Science. 1970;168(3936):1159. doi:10.1126/science.168.3936.1159.

49. Mechoulam R, Ben-Zvi Z, Yagnitinsky B, Shani A. A new tetrahydrocannabinolic acid. Tetrahedron Lett. 1969;28:2339–2341. doi:10.1016/S0040-4039(01)88158-2.

50. Merlin MD. Archaeological evidence for the tradition of psychoactive plant use in the old world. Econ Bot. 2003;57(3):295–323. doi:10.1663/0013-0001(2003)057[0295:AEFTTO]2.0.CO;2.

51. Moore C, Rana S, Coulter C. Simultaneous identification of 2-carboxy-tetrahydrocannabinol, tetrahydrocannabinol, cannabinol and cannabidiol in oral fluid. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci. 2007;852(1-2):459–464. doi:10.1016/j.jchromb.2007.02.016.

52. Moreno-Sanz G. Can you pass the acid test? Critical review and novel therapeutic perspectives of Δ9-tetrahydrocannabinolic acid A. Cannabis Cannabinoid Res. 2016;1(1):124–130. doi:10.1089/can.2016.0008.

53. Morimoto S, Komatsu K, Taura F, Shoyama Y. Enzymological evidence for cannabichromenic acid biosynthesis. J Nat Prod. 1997;60(8):854–857. doi:10.1021/np970210y.

54. Morimoto S, Komatsu K, Taura F, Shoyama Y. Purification and characterization of cannabichromenic acid synthase from Cannabis sativa. Phytochemistry. 1998;49(6):1525–1529. doi: 10.1016/S0031-9422(98)00278-7.

55. Mudge EM, Brown PN, Murch SJ. The terroir of cannabis : Terpene metabolomics as a tool to understand Cannabis sativa selections. Planta Med. 2019;85(9/10):781–796. doi:10.1055/a-0915-2550.

56. Onofri C, de Meijer EPM, Mandolino G. Sequence heterogeneity of cannabidiolic- and tetrahydrocannabinolic acid-synthase in Cannabis sativa L. and its relationship with chemical phenotype. Phytochemistry. 2015;116:57–68. doi:10.1016/j.phytochem.2015.03.006.

57. Page JE, Nagel J. Biosynthesis of Terpenophenolic Metabolites in Hop and Cannabis. In:Romeo JT, editor. Recent Advances in Phytochemistry, vol. 40. Oxford: Elsevier; 2006. p 179-210.

58. Page JE, Stout JM. Cannabichromenic acid synthase from Cannabis sativa. 2019.

59. Pellati F, Borgonetti V, Brighenti V, Biagi M, Benvenuti S, Corsi L. Cannabis sativa L. and nonpsychoactive cannabinoids: Their chemistry and role against oxidative stress, inflammation, and cancer. Biomed Res Int. 2018;2018:1691428. doi:10.1155/2018/1691428.

60. Perrotin-Brunel H, Buijs W, Spronsen J v, Roosmalen MJE v, Peters CJ, Verpoorte R, Witkamp G-J. Decarboxylation of Δ9-tetrahydrocannabinol: Kinetics and molecular modeling. J Mol Struct. 2011;987(1):67–73. doi:10.1016/j.molstruc.2010.11.061.

61. Pertwee RG. Handbook of experimental pharmacology. Heidelberg: SpringerVerlag; 2005.

62. Pertwee RG. The diverse CB1 and CB2 receptor pharmacology of three plant cannabinoids: Δ9-tetrahydrocannabinol, cannabidiol and Δ9-tetrahydrocannabivarin. Br J Pharmacol. 2008;153(2):199–215. doi:10.1038/sj.bjp.0707442.

63. Petrosino S, Verde R, Vaia M, Allara M, Iuvone T, Di Marzo V. Anti-inflammatory properties of cannabidiol, a nonpsychotropic cannabinoid, in experimental allergic contact dermatitis. J Pharmacol Exp Ther. 2018;365(3):652–663. doi:10.1124/jpet.117.244368.

64. Radwan MM, El Sohly MA, El-Alfy AT, Ahmed SA, Slade D, Husni AS, Manly SP, Wilson L, Seale S, Cutler SJ, Ross SA. Isolation and pharmacological evaluation of minor cannabinoids from high-potency Cannabis sativa. J Nat Prod. 2015;78(6):1271–1276. doi:10.1021/acs.jnatprod.5b00065.

65. Raikos N, Schmid H, Nussbaumer S, Ambach L, Lanz S, Langin A, Konig S, Roth N, Auwarter V, Weinmann W. Determination of Δ9-tetrahydrocannabinolic acid A (Δ9-THCA-A) in whole blood and plasma by LC-MS/MS and application in authentic samples from drivers suspected of driving under the influence of cannabis. Forensic Sci Int. 2014;243:130–136. doi:10.1016/j.forsciint.2014.07.026.

66. Reekie TA, Scott MP, Kassiou M. The evolving science of phytocannabinoids. Nat Rev Chem. 2017;2(1):0101. doi:10.1038/s41570-017-0101. [CrossRef] [Google Scholar]

67. Russo E. Cannabis in India: ancient lore and modern medicine. In: Mechoulam R, editor. Cannabinoids as Therapeutics. Basel: Birkhäuser Verlag; 2005. pp. 1–22.

68. Russo EB. Taming THC: Potential cannabis synergy and phytocannabinoid-terpenoid entourage effects. Br J Pharmacol. 2011;163(7):1344–1364. doi:10.1111/j.1476-5381.2011.01238.x.

69. Russo EB. The pharmacological history of Cannabis. In: Pertwee RG, editor. Handbook of Cannabis. Oxford: Oxford University Press; 2014. pp. 23–43.

70. Šantavý F. Notes on the structure of cannabidiol compounds. Acta Univ Palacki Olomuc. 1964;35:5-9.

71. Scheckel CL, Boff E, Dahlen P, Smart T. Behavioral effects in monkeys of racemates of two biologically active marijuana constituents. Science. 1968;160(3835):1467–1469. doi:10.1126/science.160.3835.1467.

72. Shahbazi F, Grandi V, Banerjee A, Trant JF. Cannabinoids and cannabinoid receptors: The story so far. iScience. 2020;23(7):101301.

73. Shoyama Y, Tamada T, Kurihara K, Takeuchi A, Taura F, Arai S, Blaber M, Shoyama Y, Morimoto S, Kuroki R. Structure and function of ∆1-tetrahydrocannabinolic acid (THCA) synthase, the enzyme controlling the psychoactivity of Cannabis sativa. J Mol Biol. 2012;423(1):96–105. doi:10.1016/j.jmb.2012.06.030.

74. Shoyama Y, Yagi M, Nishioka I, Yamauchi T. Biosynthesis of cannabinoid acids. Phytochemistry. 1975;14(10):2189–2192. doi:10.1016/S0031-9422(00)91096-3.

75. Shultz ZP, Lawrence GA, Jacobson JM, Cruz EJ, Leahy JW. Enantioselective total synthesis of cannabinoids—A route for analogue development. Org Lett. 2018;20(2):381–384. doi:10.1021/acs.orglett.7b03668.

76. Sirikantaramas S, Morimoto S, Shoyama Y, Ishikawa Y, Wada Y, Shoyama Y, Taura F. The gene controlling marijuana psychoactivity: Molecular cloning and heterologous expression of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid synthase from Cannabis sativa L. J Biol Chem. 2004;279(38):39767–39774. doi:10.1074/jbc.M403693200.

77. Tan Z, Clomburg JM, Gonzalez R. Synthetic pathway for the production of olivetolic acid in Escherichia coli. ACS Synth Biol. 2018;7(8):1886–1896. doi:10.1021/acssynbio.8b00075.

78. Taura F. Studies on tetrahydrocannabinolic acid synthase that produces the acidic precursor of tetrahydrocannabinol, the pharmacologically active cannabinoid in marijuana. Drug Discov Ther. 2009;3(3):83–87.

79. Taura F, Dono E, Sirikantaramas S, Yoshimura K, Shoyama Y, Morimoto S. Production of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid by the biosynthetic enzyme secreted from transgenic Pichia pastoris. Biochem Biophys Res Commun. 2007;361(3):675–680. doi:10.1016/j.bbrc.2007.07.079.

80. Taura F, Morimoto S, Shoyama Y. Purification and characterization of cannabidiolic-acid synthase from Cannabis sativa L. Biochemical analysis of a novel enzyme that catalyzes the oxidocyclization of cannabigerolic acid to cannabidiolic acid. J Biol Chem. 1996;271(29):17411–17416. doi:10.1074/jbc.271.29.17411.

81. Taura F, Morimoto S, Shoyama Y, Mechoulam R. First direct evidence for the mechanism of Δ1-tetrahydrocannabinolic acid biosynthesis. J Am Chem Soc. 1995;117(38):9766–9767. doi:10.1021/ja00143a024.

82. Taura F, Sirikantaramas S, Shoyama Y, Shoyama Y, Morimoto S. Phytocannabinoids in Cannabis sativa: Recent studies on biosynthetic enzymes. Chem Biodivers. 2007;4(8):1649–1663. doi:10.1002/cbdv.200790145.

83. Taura F, Sirikantaramas S, Shoyama Y, Yoshikai K, Shoyama Y, Morimoto S. Cannabidiolic-acid synthase, the chemotype-determining enzyme in the fiber-type Cannabis sativa. FEBS Lett. 2007;581(16):2929–2934. doi:10.1016/j.febslet.2007.05.043.

84. Taura F, Tanaka S, Taguchi C, Fukamizu T, Tanaka H, Shoyama Y, Morimoto S. Characterization of olivetol synthase, a polyketide synthase putatively involved in cannabinoid biosynthetic pathway. FEBS Lett. 2009;583(12):2061–2066. doi:10.1016/j.febslet.2009.05.024.

85. Taura F, Tanaya R, Sirikantaramas S. Recent advances in cannabinoid biochemistry and biotechnology. ScienceAsia. 2019;45:399. doi:10.2306/scienceasia1513-1874.2019.45.399.

86. Thomas BF, ElSohly MA. The Analytical Chemistry of Cannabis: Quality assessment, assurance and regulation of medicinal marijuana and cannabinoid preparations. 1. Amsterdam: Elsevier; 2016.

87. Turner CE, Elsohly MA, Boeren EG. Constituents of Cannabis sativa L. XVII. A review of the natural constituents. J Nat Prod. 1980;43(2):169–234. doi:10.1021/np50008a001.

88. United Nations Office on Drugs and Crime . 2005 World Drug Report. 2005.

89. van Bakel H, Stout JM, Cote AG, Tallon CM, Sharpe AG, Hughes TR, Page JE. The draft genome and transcriptome of Cannabis sativa. Genome Biol. 2011;12(10):R102. doi:10.1186/gb-2011-12-10-r102.

90. Wakshlag JJ, Cital S, Prussin R, Eaton SJ, Hudalla C. Cannabinoid, terpene, and heavy metal analysis of 29 over-the-counter commercial veterinary hemp supplements. Vet Med. 2020;11:45–55.

91. Wall ME, Perez-Reyes M. The metabolism of Δ9-tetrahydrocannabinol and related cannabinoids in man. J Clin Pharmacol. 1981;21(S1):178S–189S. doi:10.1002/j.1552-4604.1981.tb02594.x.

92. Wang M, Wang Y-H, Avula B, Radwan MM, Wanas AS, Antwerp J v, Parcher JF, ElSohly MA, Khan IA. Decarboxylation study of acidic cannabinoids: A novel approach using ultra-high-performance supercritical fluid chromatography/photodiode array-mass spectrometry. Cannabis Cannabinoid Res. 2016;1(1):262–271. doi:10.1089/can.2016.0020.

93. Wollner HJ, Matchett JR, Levine J, Loewe S. Isolation of a physiologically active tetrahydrocannabinol from Cannabis sativa resin. J Am Chem Soc. 1942;64:26–29. doi:10.1021/ja01253a008.

94. Yang X, Matsui T, Kodama T, Mori T, Zhou X, Taura F, Noguchi H, Abe I, Morita H. Structural basis for olivetolic acid formation by a polyketide cyclase from Cannabis sativa. FEBS J. 2016;283(6):1088–1106. doi:10.1111/febs.13654.

95. Zager JJ, Lange I, Srividya N, Smith A, Lange BM. Gene networks underlying cannabinoid and terpenoid accumulation in cannabis. Plant Physiol. 2019;180(4):1877–1897. doi:10.1104/pp.18.01506.

96. Zirpel B. Recombinant expression and functional characterization of cannabinoid producing enzymes in Komagataella phaffii. Dortmund: Technischen Universität Dortmund (Germany); 2018.

97. Zirpel B, Kayser O, Stehle F. Elucidation of structure-function relationship of THCA and CBDA synthase from Cannabis sativa. J Biotechnol. 2018;284:17–26. doi:10.1016/j.jbiotec.2018.07.031.

Άρθρα από το Journal of Cannabis Research παρέχονται εδώ με την ευγενική προσφορά του BioMed Central.

(το άρθρο σε μορφή αρχείου PDF)